Clostridium difficile toxigênico, pesquisa do DNA, fezes

Orientações necessárias

I - Informações sobre o exame

• Este exame é indicado exclusivamente para pessoas com quadro diarréico.

II - Critérios de realização

• A amostra deve ser colhida em frasco sem conservador.
• Crianças que não usam fralda e adultos devem evacuar diretamente no frasco plástico grande, presente no kit, fechar o recipiente com a trava disponível e colocá-lo dentro do saco plástico tipo Zip.
• Para crianças que usam fralda ou que estão com diarreia, a amostra pode ser obtida por meio de saquinho do tipo "coletor de urina" e entregue nesse mesmo invólucro.
• Quando armazenado no frasco, o material também deve ser encaminhado ao laboratório em até duas hora após a coleta, se estiver refrigerada entre 2º a 8ºC por até 72 horas

Atenção: Para a entrega do material, é necessário consultar restrição de atendimento de horários das unidades.

Processamento e adequação da amostra

• Receber a amostra em frasco sem conservador de acordo com as condições abaixo:
• O material permanece estável nas seguintes condições

-- por duas hora em temperatura ambiente;

-- por 72 horas se refrigerada entre 2ºC a 8º C

Hospital Sírio Libanês:

• Processar a amostra no GeneXpert e liberar laudo conforme descrito na POP-HOS-196.
• Todas as amostras devem ser congeladas e armazenadas em freezer na Microbiologia do Hospital Sírio Libanês após a análise.

Método

• PCR em tempo real - GeneXpert.

Valor de referência

• Indetectável

Interpretação e comentários

• O teste que isoladamente tem melhor desempenho no diagnóstico das diarreias por C. difficile é a pesquisa do DNA do C. difficile nas fezes, por PCR em tempo real, utilizando-se o sistema GeneXpert. O tempo de análise no equipamento é de 45 minutos.

É importante ressaltar que o consenso europeu (Crobach et al. 2016) mais recente recomenda que os casos positivos na PCR sejam testados para glutamato desidrogenase (GDH) e sejam considerados como confirmados apenas aqueles positivos para ambos os testes. Entretanto, em estudo realizado no Fleury, em 150 amostras consecutivas de pacientes distintos, com uma positividade de 35%, a PCR apresentou sensibilidade de 98,0% e especificidade de 99,0% quando comparada à cultura toxigênica. Este achado evidencia a PCR como o teste mais sensível e específico e subsidia o uso isolado da PCR para avaliação de pacientes com diarreia e suspeita clínica de C. difficile, mas há necessidade de avaliação em populações com diferentes taxas de incidência.

• Segundo o consenso europeu (Crobach et al. 2016), a positividade simultânea dos testes para GDH e toxinas A e B, na presença de diarreia e epidemiologia sugestiva, é critério diagnóstico para diarreia por C. difficile. No mesmo estudo realizado no Fleury, o teste para GDH apresentou 98,0% de sensibilidade e 91,7% de especificidade, enquanto esses valores foram 51,0% e 100% para a pesquisa de toxinas A e B. O tempo de análise é de 30 minutos.

Quando há positividade para GDH e negatividade para as toxinas, com clínica compatível com a infecção por C. difficile, recomenda-se realizar a PCR ou a cultura toxigênica para a confirmação diagnóstica. Considerando-se a baixa sensibilidade do teste para toxinas A e B, um número significativo de amostras precisam de confirmação diagnóstica por PCR ou cultura toxigênica, o que posterga o diagnóstico.

• A PCR detecta a presença do operon no qual estão localizados os genes que codificam a enterotoxina A (tcdA) e a citotoxina B (tcdB), bem como seu regulador (tcdC). Além disso, identifica o gene cdtB, que codifica uma das subunidades da toxina binária. Quando há detecção de C. difficile é também avaliada a integridade do gene tcdC. Esta avaliação tem como objetivo detectar cepas potencialmente hipervirulentas; entretanto, em estudo realizado no Fleury, cerca de 35% das cepas de C. difficile da cidade de São Paulo apresentaram deleção parcial deste gene, sem correlação com maior gravidade na apresentação clínica. Estes achados diferem daqueles descritos para a cepa NAP1/027 (apresenta deleção parcial do gene tcdC) na Europa e Estados Unidos.
• Este teste não deve ser utilizado para controle de tratamento, uma vez que a positividade pode persistir por pelo menos duas semanas, a despeito da eficácia do tratamento.
• A repetição do teste, em intervalo de coleta inferior a sete dias, na vigência do mesmo quadro clínico, não é recomendada. O ganho em sensibilidade é de apenas 1%. Para informações adicionais consultar Luo et. Al. J Clin Microbiol. 2010;48(10):3738-41.
• Em caso de negatividade da PCR em tempo real e suspeita clínica de diarreia por C. difficile, a cultura toxigênica de fezes é o teste recomendado para o diagnóstico.
• Em resumo, há dois algoritmos diagnósticos. O primeiro iniciando com os testes para GDH e toxinas A e B e o segundo com a PCR. São considerados como critério diagnóstico a positividade para GDH e toxinas A e B ou GDH e PCR, simultaneamente. A pesquisa de toxinas não deve ser utilizada isoladamente como ferramenta diagnóstica.