O protocolo consiste de DNA e de RNA a partir da amostra de sangue total ou de medula óssea. O protocolo segue um preparo inicial para a fragmentação das moléculas de DNA e inserção de adaptadores com indexes únicos e um outro preparo individualizado para a inserção de adaptadores com indexes distintos para as moléculas de RNA. Na sequência, ocorre o enriquecimento das regiões de interesse das moléculas de DNA e RNA (cDNA) por meio da hibridação de sondas individualizadas. A captura compreende a região codificadante de 69 genes (42 genes completos e 27 genes com regiões hotspot) e região de fusão de 27 genes principalmente envolvidos nas doenças mieloproliferativas, com sequenciamento na plataforma NextSeq500 (Illumina). Os dados do sequenciamento são processados em um programa de bioinformática desenvolvido e validado. As variantes identificadas e filtradas nesse programa passam por uma anotação gênica, análise e interpretação dos dados com base em algoritmos desenvolvidos internamente. Ressalte-se que a fusão de BCR-ABL1 apresenta um limite de detecção de 10%, pela escala internacional, neste teste. Assim, sugere-se que para acompanhamento de detecção da fusão BCR-ABL1 seja solicitado o teste de alta sensibilidade por PCR em tempo real (QBCRABL ou PH1PCR).

Descritivo

"O painel de mutações para neoplasias mieloides está baseado no sequenciamento de nova geração de 69 genes (42 genes completos e 27 genes com regiões hotspot) e de região de fusão de 27 genes principalmente envolvidos nas neoplasias mieloides
São verificadas as seguintes alterações:
- alterações de nucleotídeo único (SNVs),
- pequenas inserções e deleções (INDELS)
- fusões gênicas
O ensaio fornece o perfil de mutações e o percentual de apresentação das variantes, ao diagnóstico e em amostras pós-tratamento, porém para estas últimas a sensibilidade pode, eventualmente, ser insuficiente.
Lista dos 69 genes avaliados com os respectivos éxons de interesse (para alterações de SNV e INDELS por sequenciamento de DNA):
ABL1 (4-9); ANKRD26 (1-4); ASXL1 (completo); ATM (completo); ATRX (8-10 e 15-31); BCOR (completo); BCORL1 (completo); BRAF (6, 11-16, 18); CALR (completo); CBL (8 e 9); CBLB (9 e 10); CBLC (9 e 10); CDKN2A (completo); CDKN2B (completo); CEBPA (completo); CREBBP (completo); CSF3R (14-17); CUX1 (completo); DDX41 (completo); DNMT3A (completo); ELANE (completo); ETNK1 (2-5); ETV6 (completo); EZH2 (completo); FBXW7 (9-12); FLT3* (11, 14-21); GATA1 (2-4); GATA2 (completo); GNAS (8 e 9); HRAS (completo); IDH1 (4); IDH2 (4); IKZF1 (completo); JAK2 (completo); JAK3 (completo); KDM6A (completo); KIT (2, 8-11, 13,14, 17, 18); KMT2A (completo); KRAS (completo); MPL (10-12); MYD88 (completo); NF1 (completo); NOTCH1 (3-6, 8, 10, 13, 15, 17, 18, 20, 25-28, 32-34); NPM1 (7, 9-11); NRAS (2 e 3); PDGFRA (12, 14 e 18); PHF6 (completo); PRPF8 (completo); PTEN (completo); PTPN11 (1-4, 6-13); RAD21 (completo); RB1 (completo); RUNX1 (completo); SETBP1 (4); SF3B1 (10-16, 19); SH2B3 (completo); SMC3 (4, 6, 7, 9, 11-13, 15, 16, 18-21, 23-25, 27, 28); SRP72 (6 e 10); SRSF2 (completo); STAG2 (completo); STAT3 (completo); STK11 (completo); TERC (completo); TERT (completo); TET2 (completo); TP53 (completo); U2AF1 (2, 6, 8); WT1 (completo); ZRSR2 (completo)
*Variantes do tipo ITD (duplicação interna em tandem) e TKD (domínio tirosinoquinase) no gene FLT3 são pesquisadas por meio da técnica de eletroforese capilar

Lista dos 27 genes principais para análise de fusões (sequenciamento de RNA)
ABL1; ABL2; CREBBP; CRLF2; CSF1R; EPOR; ERG; ETV6; FGFR1; FLT3; IKZF1; JAK2; KMT2A; MECOM; MEF2D; MKL1; MLLT10; MYH11; NF1; NOTCH1; NUP214; NUTM1; PDGFRA; PDGFRB; RARA; RUNX1; ZNF384
As fusões envolvendo os 27 genes principais podem ocorrer com diferentes genes parceiros, totalizando 93 fusões conhecidas (lista abaixo). Além disso o nosso teste é capaz de detectar fusões envolvendo os 27 genes com novos parceiros.

Lista das 93 fusões conhecidas analisadas:
KMT2A::SEPT9; KMT2A::MLLT10; KMT2A::MLLT3; KMT2A::MLLT6; KMT2A::ACTN4; KMT2A::EPS15; KMT2A::MLLT11; KMT2A::MLLT4; KMT2A::SEPT6; KMT2A::ABI1; KMT2A::ELL; KMT2A::AFF1; KMT2A::CEP170B; KMT2A::SEPT2; KMT2A::AFF4; KMT2A::AFF3; KMT2A::TET1; KMT2A::KNL1; KMT2A::ARHGAP26; KMT2A::CREBBP; KMT2A::FOXO3; KMT2A::SEPT5; KMT2A::GAS7; KMT2A::EP300; KMT2A::MLLT1; KMT2A::CASP8AP2; BCR::ABL1; ETV6::ABL1; NUP214::ABL1; RANBP2::ABL1; RCSD1::ABL1; ETV6::FLT3; ETV6::ITPR2; ETV6::JAK2; ETV6::NTRK3; ETV6::PDGFRB; ETV6::MN1; ETV6::RUNX1; ETV6::MECOM; ETV6::MNX1; BCR::JAK2; PAX5::JAK2; PCM1::JAK2; SSBP2::JAK2; STRN3::JAK2; FGFR1::PLAG1; FGFR1::TACC1; FGFR1::ZNF703; FGFR1::BAG4; FGFR1::ERLIN2; BCR::PDGFRA; FIP1L1::PDGFRA; AGGF1::PDGFRB; DOCK2::PDGFRB; EBF1::PDGFRB; SATB1::PDGFRB; MEF2D::CSF1R; SSBP2::CSF1R; MEF2D::SS18; MEF2D::BCL9; MEF2D::DAZAP1; MEF2D::HNRNPUL1; TBL1XR1::MECOM; H2AFY::MECOM; EIF4A2::MECOM; DEK::NUP214; SET::NUP214; IGHJ5::CRLF2; IGHJ6::CRLF2; IKZF1::TYW1; IKZF1::DNAH14; ACIN1::NUTM1; IKZF1::NUTM1; CUX1::NUTM1; SLC12A6::NUTM1; BRD4::NUTM1; ERG::DUX4; ERG::FUS; SEC16A::NOTCH1; GABBR2::NOTCH1; EP300::ZNF384; TCF3::ZNF384; CREBBP::ZNF384; FLT3::MYO18A; RBM15::MKL1; CBFB::MYH11; PML::RARA; RUNX1::RUNX1T1; PAG1::ABL2; NF1::ASIC2; PICALM::MLLT10; CREBBP::KAT6A; IGHJ5::EPOR.

OBSERVAÇÃO 1: A fusão de BCR-ABL1 possui limite de detecção de 10% na escala internacional. Para acompanhamento de detecção da fusão BCR-ABL1 é indicado o teste de alta sensibilidade por PCR em tempo real (QBCRABL ou PH1PCR).

GenBank (GRCh37 / hg19) dos 69 genes analisados (SNVs e InDels) (para alterações de SNV e INDELS por sequenciamento de DNA):
ABL1 (NM_007313); ANKRD26 (NM_001256053); ASXL1 (NM_015338); ATM (NM_000051); ATRX (NM_000489); BCOR (NM_001123383); BCORL1 (NM_021946); BRAF (NM_004333); CALR (NM_004343); CBL (NM_005188); CBLB (NM_170662); CBLC (NM_012116); CDKN2A ( NM_001195132); CDKN2B (NM_004936); CEBPA (NM_004364); CREBBP ( NM_004380); CSF3R (NM_156039); CUX1 (NM_001913); DDX41 (NM_016222); DNMT3A ( NM_153759); ELANE (NM_001972); ETNK1 (NM_018638); ETV6 (NM_001987); EZH2 (NM_004456); FBXW7 (NM_033632); FLT3 (NM_004119); GATA1 (NM_002049); GATA2 (NM_001145661); GNAS (NM_000516); HRAS (NM_001130442); IDH1 (NM_005896); IDH2 (NM_002168); IKZF1 (NM_001220765); JAK2 (NM_004972); JAK3 (NM_000215); KDM6A (NM_021140); KIT (NM_000222); KMT2A (NM_001197104); KRAS (NM_004985); MPL (NM_005373); MYD88 ( NM_002468); NF1 (NM_000267); NOTCH1 (NM_017617); NPM1 (NM_002520); NRAS (NM_002524); PDGFRA (NM_006206); PHF6 (NM_032458); PRPF8 (NM_006445); PTEN (NM_000314); PTPN11 (NM_002834); RAD21 (NM_006265); RB1 (NM_000321); RUNX1 (NM_001754); SETBP1 (NM_015559); SF3B1 (NM_012433); SH2B3 (NM_005475); SMC3 (NM_005445); SRP72 (NM_006947); SRSF2 (NM_003016); STAG2 (NM_006603); STAT3 (NM_139276); STK11 (NM_000455); TERC (NR_001566); TERT (NM_198253); TET2 (NM_001127208); TP53 (NM_000546); U2AF1 (NM_001025203); WT1 (NM_024426); ZRSR2 ( NM_005089).

" Receber a amostra sob refrigeração (2ºC a 8ºC)

Não manusear.
Enviar o material o mais rápido possível para a seção, refrigerado acompanhado do questionário.
Não será aceito material enviado em seringa com agulha.

Estabilidades das amostras:
Temperatura ambiente: não aceitável
Refrigerada (2ºC a 8ºC): 5 dias
Congelada: não aceitável

INCLUIR
Atenção: encaminhar o material primeiramente para a ACGenômica e protocolar a etiqueta da seção BMO

I Informações sobre o exame
A análise pode ser realizada em amostras de sangue periférico ou de medula óssea, a critério médico, colhidas ou não no Fleury.
Se este exame for colhido após uma dieta leve, não é necessário jejum. Se, contudo, for feito depois do almoço ou do jantar, deve haver um intervalo de três horas entre a refeição e a coleta.
Caso a amostra de medula óssea vá ser colhida no Fleury, o cliente deve agendar o procedimento previamente.
Se a coleta não for realizada no Fleury a amostra deve ser mantida sob refrigeração (2ºC a 8ºC)

Para saber sobre estes exames e como realizar, acesse:
https://www.fleurygenomica.com.br/